Labgids.be

Het NGS RNA fusiepanel (RNA-O) is een custom-designed en door TWIST Bioscience ontwikkelde pre-analytische library prep (capture-based). De target regio's voor dit panel werden door AZ Sint-Lucas gedefinieerd voor vaste tumoren en hematologische maligniteiten. Analyse gebeurt met een NextSeq550Dx instrument en een mid-output 150 cycli flow cell.

Deze test is ISO15189 geaccrediteerd (377-MED) voor de detectie van genfusies en een beperkt aantal splicing varianten ongeacht de indicatie, alsook voor de aanwezigheid van SNV en kleine inserties en deleties (<60 bp) in volgende 5 genen bij NSCLC: BRAF, EGFR, ERBB2, KRAS, MET (en ALK in geval van progressie binnen 1 jaar).

Variant analyse in andere genen, microsatelliet instabiliteit status, genexpressie en chromosomale aberraties zijn niet ISO15189 geaccrediteerd (377-MED). Variant analyse bij alle andere indicaties wordt uitgevoerd op DNA niveau.

Fusie analyse

Volgende 124 drivergenen worden geanalyseerd op potentiële fusies: ABL, ABL2, AKT2, AKT3, ALK, ANK2, AR, ARHGAP26, AXL, BCL2, BCL6, BCOR, BRAF, CBFB, CCND1, CCND2, CCND3, CDK4, CDKN2A, CEBPA, CIC, CREBBP, CRLF2, CRTC1, CSF1R, DDX41, DEK, EEF1A2, EGFR, ERBB2, ERBB4, ERG, ESR1, ETV1, ETV4, ETV5, ETV6, EWSR1, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGR, FIP1L1, FLI1, FLT3, FOXR1, GATA1, GATA2, GLIS2, IGF2BP3, INSR, IRF4, JAK2, JAZF1, KANSL1, KAT6A, KDM5A, KIT, KMT2A, MAML2, MAMLD1, MAP2K2, MAST1, MAST2, MECOM, MET, MGA, MITF, MITF, MTOR, MYB, MYBL1, MYC, MYH11, NAB2, NFIB, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NRG1 III b3, NSD1, NSD3, NTRK1, NTRK2, NTRK3, NUP98, NUP214, NUTM1, PCM1, PDGFB, PDGFRA, PDGFRB, PHF1, PIK3CA, PIK3C2G, PPARG1, PRKCA, PRKACA, PRKACB, RAD51B, RAF1, RARA, RBM15, RELA, RET, ROS1, RPN1, RSPO3, RUNX1, RUNX1T1, SKIL1, SMARCB1, STAT6, SUZ12, TCF3, TERT, TFE3, TFEB, TGM7, TP63, USP6, YAP1, ZFTA.

Uitsluitend (vermoedelijk) pathogene fusies met minimaal 3 ondersteunende (junction en spanning) reads worden gerapporteerd volgens HGNC richtlijnen (Bruford et al., Leukemia 2021). Aangezien het een capture-based panel betreft, kunnen ook nieuwe fusies worden gedetecteerd. Tevens wordt er gescreend op alternatieve splicing varianten: EGFR variant III en MET exon 14 skipping.

In het klinisch rapport worden alle (vermoedelijk) pathogene fusies (inclusief splicing varianten) opgenomen en besproken in het besluit. Indien de totale coverage van een staal lager is dan de gevalideerde grenswaarde, waardoor de vooropgestelde gevoeligheid voor de detectie van fusies niet kan gegarandeerd worden, wordt dit eveneens vermeld in het klinisch rapport. Er worden geen fusies met ongekende significantie (VUS) opgenomen in het klinisch rapport.

Variant analyse

Variant analyse (SNV en kleine indels) is ISO15189 geaccrediteerd (377-MED) voor 5 klinisch-relevante genen in NSCLC: BRAF (exon 11, 15), EGFR (exon 18-21), ERBB2 (exon 20), KRAS (exon 2-4), MET (exon 13-15) (en ALK exon 20-25 in geval van progressie binnen 1 jaar).

Er wordt eveneens variant analyse uitgevoerd bij andere genen van het panel doch deze analyse is niet ISO15189 (377-MED) geaccrediteerd. Er worden uitsluitend (vermoedelijk) pathogene mutaties met een variant allel frequentie (VAF) vanaf 5% bij minimaal 200x gerapporteerd (rapporteringslimiet). (Vermoedelijk) pathogene varianten kunnen enkel worden gedetecteerd indien het desbetreffende gen voldoende tot expressie wordt gebracht. Bij de NSCLC-specifieke genen werden geen technische drop-outs gedetecteerd. In andere genen kan bij te lage coverage (<200x) geen onderscheid gemaakt worden tussen technische dropout of te weinig biologische expressie van het gen. Tumor suppressor genen worden full-exon getarget.

In het klinisch rapport worden enkel (vermoedelijk) pathogene varianten of afwijkingen opgenomen. Klinisch-relevante varianten, afwijkingen of wildtype genen worden besproken in het besluit. Bovendien worden bij NSCLC targetregio’s gemarkeerd in de 5 klinisch-relevante genen indien de coverage <200x is en aldus de 5% rapporteringslimiet voor deze regio’s niet kan behaald worden. In geval van suboptimale kwaliteit wordt de rapporteringslimiet verhoogd naar 10% variant frequentie, zoals eveneens aangegeven in het klinisch rapport. Potentiële kiemcel bevindingen in het kader van kankersyndromen dienen klinisch gecorreleerd te worden.

Verder worden 38 microsatellieten gecontroleerd ter bepaling van de MSI status.

Bij vaste tumoren wordt de H&E weefselcoupe van de geselecteerde paraffineblok nagekeken op tumorcel percentage. Minimaal vereist tumorcelpercentage: 20%.

Gebruikte referentiesequentie: GRCh38.p14 (GENCODE v37)

Extra informatie betreffende het gebruikte NGS panel (targets), transcript nummers, bioinformatica toepassingen, biologische en klinische classificatie van fusies, datastromen en klinisch-relevante genen per indicatie, kan worden geconsulteerd op www.labgids.be.

Volgende interne afspraken betreffende archivering van sequencing data:

1.      Intern: volledige ‘pull’ van S3 processed data:

5 jaar bijhouden van deze output data

Na 5 jaar worden alle data verwijderd

2.      Intern: fastq’s:

1 jaar bewaring

3.      Extern (AWS): fastq’s én processed data  

1 maand bewaring