Labgids.be

Het NGS vaste tumor panel is een custom-designed en door TWIST ontwikkelde pre-analytische library prep (capture-based). De target regio’s voor het vaste tumor panel werden door AZ St. Lucas gedefinieerd. Analyse gebeurt met een NextSeq550Dx en een mid-output 150 cycle flow cell.

Volgende 100 genen worden geanalyseerd op puntmutaties (SNV), kleine inserties en/of selectieve genamplificaties:

AKT1, ALK, AR, ARAF, ARID1A, ARID5B, ATM, BAP1, BARD1, BCOR, BRAF, BRCA1, BRCA2, BRIP1, CCND1, CCNE1, CDK12, CDK4, CDK6, CDKN2A, CHEK1, CHEK2, CIC, CTNNB1, DDR2, DPYD, EGFR, EPHA7, ERBB2, ERBB3, ERBB4, ERCC2, ESR1, FAM175A, FANCL, FANCM, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FOXL2, GATA3, GLI1, GNA11, GNAQ, GNAS, H3C2, H3C3, H3F3A, HRAS, IDH1, IDH2, KAT6A, KDR, KEAP1, KIT, KRAS, MAP2K1, MCL1, MDM2, MEN1, MET, MGA, MYC, NRAS, NTRK1, NTRK3, PAK5, PALB2, PBRM1, PDGFRA, PIK3CA, PIK3R1, POLD1, POLE, POLQ, PPP2R1A, PTEN, PTPRT, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD54L, RAF1, RB1, RET, ROS1, SETD2, SLCO1B1, SMAD4, SMARCA4, SMO, STK11, TERT (promoter), TET1, TP53, UGT1A1, VHL, YES1

Verder worden 14 microsatellieten gecontroleerd ter bepaling van de MSI status:

MSI_ACVR2A, MSI_BAT25_KIT, MSI_BAT26_MSH2, MSI_BTBD7, MSI_CAT25_CASP2, MSI_DIDO_3UTR, MSI_MRE11, MSI_NR21_SLC7A8, MSI_NR22_STT3A, MSI_NR24_ZNF2, MSI_NR27_BIRC3, MSI_RYR3, MSI_SEC31A, MSI_SULF2_3UTR.

Tenslotte wordt op basis van 301 hypervariabele SNP’s gescreend voor volgende chromosomale aberraties:

+7, -10, 13q deletie, 1p/19q codeletie.  

Er worden uitsluitend (vermoedelijk) pathogene mutaties met een variant allel frequentie (VAF) vanaf 5% bij minimaal 200x gerapporteerd (rapporteringslimiet). In geval van een specifieke klinische vraagstelling kunnen (vermoedelijk) pathogene varianten vanaf 2% VAF bij >500x worden gerapporteerd (detectielimiet). Indien lagere coverage optreedt, wordt de VAF cutoff trapsgewijs verhoogd (minimaal tumorcelpercentage 20%):

<50x: geen variant calling mogelijk (gerapporteerd als ‘low coverage’ regio’s)

50x - 199x coverage: VAF vanaf 10%

200x - 499x coverage: VAF vanaf 5%

vanaf 500x: coverage: VAF vanaf 2%

In het klinisch rapport worden alle (vermoedelijk) pathogene varianten of afwijkingen opgenomen evenals (kiemcel) varianten in het kader van farmacogenetica die geassocieerd zijn met een verminderde activiteit. Klinisch-relevante varianten, afwijkingen of wildtype genen per indicatie worden besproken in het besluit. Bovendien worden genen of targetregio’s weergegeven als suboptimaal gecoverd wanneer de coverage <200x is en aldus de 5% rapporteringslimiet voor deze regio’s niet kan behaald worden. In genen die niet vermeld zijn in de “Varianten” of “Farmacogenetica” sectie, werd geen (vermoedelijk) pathogene mutatie of respectievelijk variant geassocieerd met verminderde activiteit gedetecteerd. Tot slot worden in het rapport eveneens varianten met ongekende significantie (VUS) gerapporteerd met een variant frequentie vanaf 10%. In geval van suboptimale sequencing coverage of kwaliteit wordt de rapporteringslimiet verhoogd naar 10% variant frequentie, zoals eveneens aangegeven in het klinisch rapport. Potentiële kiemcel bevindingen in het kader van kankersyndromen dienen klinisch gecorreleerd te worden.

De (vermoedelijk) pathogene varianten worden eveneens klinisch geclassificeerd aan de hand van drie klassen:

- Klasse I: Significant klinisch belang

- Klasse 2: Mogelijk klinisch belang

- Klasse 3: Ongekende klinische betekenis

De tumor suppressorgenen (ATM, BRCA1, BRCA2, FANCL, BAP1, CHEK1, CHEK2, PALB2, RAD51B, RAD51C, RAD51D, RAD54L, ARID1A, BARD1, BRIP1, CDKN2A, ERCC2, FBXW7, POLE, PTEN, SMAD4, TP53, PIK3R1, SMARCA4, POLD1, KEAP1, STK11, CIC, PTPRT, EPHA7, ARID5B, BCOR, TET1, RB1, VHL, SETD2, FAM175A, PAK5, GATA3, MGA, PBRM1, MEN1, CDK12, FANCM, POLQ) worden full-exon getarget doch te laag gecoverde regio’s (drop-outs) kunnen niet uitgesloten worden

Gebruikte referentiesequentie: GRCh38.p14 (Refseq 110)

Voor de biologische en klinische interpretatie van varianten worden diverse bronnen gebruikt: 

WHO gids (2016)       

www.mycancergenome.org

https://pct.mdanderson.org

www.cbioportal.org

www.varsome.com

https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic

www.oncokb.org

https://p53.iarc.fr/

http://vps338341.ovh.net/ (TP53 seshat database)

https://ckbhome.jax.org/

https://arup.utah.edu/database/BRCA/                                                                                         

https://brcaexchange.org/variants 

https://www.compermed.be/nl/guidelines

Voor vaste tumoren wordt de H&E weefselcoupe van de geselecteerde paraffineblok nagekeken op tumorcel percentage. Minimaal vereist tumorcelpercentage: 20%.

Enkel de aanwezigheid van SNV en kleine inserties en deleties (<60 bp) zijn ISO15189 geaccrediteerd (377-MED). De detectie van ‘Large genomic rearrangements (LGR)’ in BRCA1 en BRCA2, microsatelliet instabiliteit status, gen amplificaties (CNV), en chromosomale aberraties (e.g. 1p19q codeletie) zijn niet ISO15189 geaccrediteerd.

In bijlage:

1. De werkstroom voor de (biologische en klinische) classificatie van varianten
2. Gebruikte transcriptnummers
3. Indicaties en klinisch-relevante genen
4. Algemene info NGS panels

Uitvoering:

Nucleïnezuurextractie: maandag en/of dinsdagnamiddag

Library prep: woensdag en donderdag

Sequencing: donderdag

Rapportering: vrijdag

(variaties mogelijk)

Kankersyndromen:

In het panel zijn genen opgenomen die geassocieerd zijn met kankersyndromen en aldus bij VAF 40-60% en >90% kunnen wijzen op een familiaal kankersyndroom. Bij omschakeling naar de nieuwe methode werd verwezen naar het feit dat geen onderscheid kan gemaakt worden tussen somatische of kiemcel varianten, naar analogie met de vorige methode. De voornaamste kankersyndromen zijn:

- HBOC

borst - ovarium

BRCA1

BRCA2

- Cowden

                pan cancer

PTEN

- Lynch/HNPCC

gastrointestinaal - endometriaal 

mutatie in MMR genen - MSI-high fenotype

- Li-Fraumeni

pan cancer

TP53

- MEN (endocriene klieren)

hypofyse, parathyroid, en pancreas

                MEN1

medullair thyroid carcinoom

                MEN2

- FAMMM (familiaal melanoom)

CDKN2A

Potentiële kiemcel bevindingen in het kader van kankersyndromen dienen klinisch gecorreleerd te worden. Het al dan niet doorsturen naar een Centrum voor Menselijke Erfelijkheid is de verantwoordelijkheid van de (behandelende) arts.

BRCA1/2 LGR:

Large Genomic Rearrangements in BRCA1/2 zijn moeilijk te detecteren met targeted NGS. De prevalentie van afwijkingen van dit type variëren sterk van zeer weinig frequent (<0.1%) tot +-10% in geval van populaties met een sterk founder effect. Varianten van dit type zijn voornamelijk als kiemcel beschreven in specifieke familiale BRCA-geassocieerde kankersyndromen (waardoor de klinische correlatie ikv menselijke erfelijkheid van belang is). Er wordt door middel van PINDEL gezocht naar ‘LGR’ in BRCA1 en BRCA2 doch dit is niet gevalideerd. Daarnaast wordt de pipeline nog verder geoptimaliseerd voor specifieke LGR detectie in BRCA1/2 detectie (Minucci A et al. Mol Biol 2020) (Musani V et al. Medicine 2017) ( Ellison G et al. Hum Mut 2018).  

TERT promoter mutaties:

85-90% van alle vaste tumoren  vertonen een verhoogde telomerase activiteit. Deze TERT reactivatie kan optreden ten gevolge van mutaties in de promoter regio, selectieve genamplificatie,  of epigenetische deregulatie (mvb methylatie). Het vaste tumor NGS panel onderzoekt de aanwezigheid van mutaties in de promoter regio. Aangezien dit een regio met bijzonder veel ruis betreft (>80% GC) wordt enkel getest op een selectie van gekende ETS binding sites. Deze selectie omvat >99% van de beschreven activerende TERT promoter mutaties. 

Genomische posities (hg38) chromosoom 5:

    - 1295155 (C270)

    - 1295135 (C250)

    - 1295128 (C243)

    - 1295127 (C242)

    - 1295114 (C229)

    - 1295113 (C228)

    - 1295094 (C209)

    - 1295078 (C193

    - 1295052 (C167)

    - 1295047 (C162)

Mutaties op andere posities van de TERT promoter worden niet gerapporteerd.

Volgende interne afspraken betreffende archivering van sequencing data:

1.      Intern: volledige ‘pull’ van S3 processed data:

5 jaar bijhouden van deze output data

Na 5 jaar worden alle data verwijderd

2.      Intern: fastq’s:

1 jaar bewaring

3.      Extern (AWS): fastq’s én processed data  

1 maand bewaring